Naukowcy z Uniwersytetu w San Jose w Kalifornii postanowili ocenić przydatność sferoidów o czterokrotnie większych rozmiarach, niż standardowe. Do tego celu użyli trójwymiarowego (3D) modelu hodowli komórkowej, metody znacznie bardziej przydatnej fizjologicznie w porównaniu do szeroko stosowanego modelu dwuwymiarowego in vitro.
Sferoidy małych rozmiarów (~500 µm) są powszechnie stosowane w badaniach nad różnorodnymi aktywnościami biologicznymi oraz fizjochemicznymi. Coraz częściej jednak wprowadza się większe modele, które dobrze nadają się do symulacji warunków mikrośrodowiska rozwoju guzów (TME).
Kalifornijski zespół badał w 2020 roku zastosowanie ultra dużych (o rozmiarach nawet 2000 µm!) sferoidów wyhodowanych za pomocą rusztowań biologicznych z użyciem bezdyszowej drukarki 3D o bardzo wysokiej rozdzielczości.
Skafoldy 3D – czym właściwie są?
Hodowle komórkowe umieszczane były w specjalnie przygotowanych rusztowaniach (skafoldach) zaprojektowanych i wyprodukowanych przez firmę Prellis Biologics za pomocą bezdyszowej drukarki 3D – Cellink Holograph X.
Skafoldy 3D to biokompatybilne struktury gwarantujące utrzymanie hodowli komórek w jednym miejscu oraz zapewniające im dostęp do tlenu. Zabezpieczona w ten sposób hodowla ma odpowiednie warunki, aby móc się prawidłowo rozwijać.
![](https://sygnis.pl/wp-content/uploads/2020/07/1.jpg)
Przyglądanie się rozwojowi komórek raka piersi
Następnie, naukowcy zajęli się badaniem wpływu używanych w chemioterapii cząsteczkowej doksorubicyny (DOX) oraz jej dwóch pochodnych związków (Dox-NP® oraz DoxovesTM), na wyhodowane duże sferoidy linii komórkowych raka piersi. Eksperyment przeprowadzono na dwóch różnych liniach komórek nowotworowych – MCF-7 oraz MDA-MB-231.
Zespół badaczy badał wpływ ww. leków, w różnych stężeniach dawek, zarówno na duże skafoldy (2000 µm), jak i te o standardowych rozmiarach (500 µm). Ocena wpływu rozmiaru rusztowania na aktywność komórkową w odniesieniu do zastosowanej dawki leku pozwoliła zobrazować atuty oraz ograniczenia ultra dużych skafoldów.
![](https://sygnis.pl/wp-content/uploads/2020/07/2-1200px.jpg)
Zespół skupił się na dwóch rozmiarach skafoldów, dla których wykonał badania dla dwóch linii komórek raka piersi (MCF-7 oraz MDA-MB-231); dla trzech leków stosowanych w chemioterapii (DOX, Dox-NP® oraz DoxovesTM) w pięciu stężeniach każdy – 0,05 µM, 0,5 µM, 5 µM i 50 µM oraz dodatkowo dla grupy kontrolnej – bez podawania leku.
Wyniki pokazały, że największe zahamowanie rozwoju komórek (po 72 godzinach od założenia hodowli) występowało dla cząsteczkowej doksorubicyny DOX, natomiast najniższe dla Dox-NP®.
![](https://sygnis.pl/wp-content/uploads/2020/07/3.jpg)
A zatem… czy rozmiar ma znaczenie?
Badania kalifornijskiego zespołu pokazały, że zarówno sferoidy o małych, jak i dużych rozmiarach, wykazują podobne trendy w rozwoju hodowli. Preparaty z lekami chemioterapeutycznymi podlegają tym samym tendencjom.
Niekwestionowaną zaletą ultra dużych skafoldów jest znaczne skrócenie czasu rozwoju hodowli – niektórym typom komórek wystarczają 24 godziny! Ich duży rozmiar jest przydatny w badaniach nad komórkami, które niełatwo tworzą sferoidy (np. użyte w tym badaniu MDA-MB-231).
Duże rozmiary pozwalają również na całkowite odtworzenie struktury 3D hodowli, dając informację o zagęszczeniu komórek w eksperymencie – właściwość, której brakuje przy użyciu skafoldów o małych rozmiarach. Analiza otrzymanych obrazów mikroskopowych dostarcza wiele informacji potrzebnych do oceny zahamowania rozwoju hodowli pod wpływem podanych dawek leku.
Wady dużych skafoldów skupiają się przede wszystkim wokół ograniczeń technologicznych, a w szczególności ich ceny. Wyprodukowanie tak dużych skafoldów jest bardzo kosztowne, znacznie bardziej niż w przypadku ich 4 lub 5-krotnie mniejszych wersji.
Dodatkowo, stosowanie rusztowań o średnicy 2000 µm wymaga opracowania indywidualnego protokołu badania dla każdego typu komórki, co może nie wydawać się istotne, lecz w rzeczywistości jest kwestią pracochłonną i wymagającą dużo uwagi.
Ponadto, naukowcy zauważyli zależność pomiędzy rozmiarem skafoldów a przenikalnością światła. Im skafold jest większy, tym ciężej jest światłu przedostać się do środka, co zaburza pozyskiwanie obrazów z użyciem barwienia fluorescencyjnego, co z kolei wpływa na jakość pozyskanych danych.
Wprowadzanie nowej metody hodowli komórek rakowych jest podstawą do dalszych badań w celu wykorzystania ultra dużych skafoldów w testach leków wykorzystywanych w walce z nowotworami.
Autor: Marta Robak
Źródło: „Assessing Advantages and Drawbacks of Rapidly Generated Ultra-Large 3D Breast Cancer Spheroids: Studies with Chemotherapeutics and Nanoparticles” International Journal of Molecular Sciences